做液相色譜的同學(xué)基本都會(huì)碰到分叉峰,
很多時(shí)候,
這都意味著硬件或者方法某些地方可能出現(xiàn)問(wèn)題。
今天我們就一起看看導(dǎo)致峰分叉的原因,
以及如何解決這個(gè)問(wèn)題。
首先,我們需要判斷,
這到底是一個(gè)峰,還是兩個(gè)峰?
a圖主峰前面有一個(gè)肩峰,
這到底是峰形不好,
還是另外一個(gè)化合物沒(méi)分開呢?
判斷方法
降低該成分在樣品中的濃度
b圖是降低該成分濃度后,
進(jìn)樣后得到的色譜圖。
如果這是一個(gè)峰,
那肩峰也應(yīng)該響應(yīng)變小,
但是這個(gè)例子里,
肩峰沒(méi)有變小,
這應(yīng)該是另外一個(gè)化合物。
這時(shí)候,我們就要考慮如何改變方法
將這兩個(gè)東西分開。
如果所有峰的峰形都不好
一般來(lái)說(shuō),
一個(gè)樣品都會(huì)出多個(gè)峰。
峰形不好,絕大多數(shù)時(shí)候
在每個(gè)峰上面都會(huì)出現(xiàn)。
比如像下面這樣:
a圖是所有峰都拖尾,
b圖是所有峰都有肩峰,
也可以說(shuō)峰分叉,
這種情況一般都是色譜柱頭塌陷
或者柱頭的篩板被堵導(dǎo)致的。
為什么會(huì)導(dǎo)致峰形問(wèn)題呢?
請(qǐng)看下面的圖
a圖是正常的柱頭,
b圖是篩板被堵的柱頭。
正常情況下,
所有樣品分子都是均勻通過(guò)色譜柱,
形成一個(gè)對(duì)稱的峰形。
堵塞的情況下,
有一部分樣品分子進(jìn)入色譜柱就會(huì)受到阻擾,
導(dǎo)致時(shí)間拖后,形成拖尾。
對(duì)于色譜柱塌陷的情況,
用同樣的方法大家也不難理解。
只不過(guò)這時(shí)候,
是一些樣品分子可能跑的比正常的快了一些。
如何解決這個(gè)問(wèn)題呢?
1 反沖
柱出口放空,
沖20-30ml流動(dòng)相。
雖然柱子上都有表明使用方向,
但是對(duì)于硅膠基質(zhì)的色譜柱
基本都可以反沖。
將柱頭污染物
如泵密封圈的碎屑,
樣品中的污染等沖走,
就能解決問(wèn)題。
當(dāng)然,還是要提倡大家注意
樣品上機(jī)之前的前處理
和及時(shí)更換磨損的泵密封圈。
有條件的還是用保護(hù)柱,
大不了就換保護(hù)柱,
也比換色譜柱強(qiáng)。
2 更換或清洗篩板
現(xiàn)在估計(jì)做這個(gè)事情的人不多,
但是誰(shuí)有廢柱子,
想練練也未嘗不可。
我們一起看看一個(gè)實(shí)際的例子
根據(jù)之前說(shuō)的,
可能是柱頭堵了,
或者塌陷了。
但是進(jìn)一步檢查,
發(fā)現(xiàn)另有原因。
方法用的150 mm 4.6 mm, 5 um C18 柱子,
78% 乙腈,1.5ml/min,等度方法,
進(jìn)樣10ul,100%乙腈溶解的樣品。
一般來(lái)說(shuō),
雖然10ul的純乙腈不會(huì)引起峰形不好,
但是有時(shí)候樣品溶劑的極性跟流動(dòng)相差異較大時(shí),
的確會(huì)引起峰形的問(wèn)題。
我們?cè)趺崔k呢?
01
從容易的辦法做起,
降低溶劑乙腈的比例,
降到50%看看。
從下圖b,4min的峰可以看出,
沒(méi)啥改觀。
02
接下來(lái)反沖柱子,
結(jié)果如圖c,
基本沒(méi)變化。
算了,明天再說(shuō)吧。
03
第二天來(lái)到實(shí)驗(yàn)室,
還能干嘛呢?
更換篩板?
算了,直接換柱子吧!
結(jié)果如d,
噢,好很多噢。
之前柱子肯定有問(wèn)題,扔了。
但是峰還是有點(diǎn)寬,
估計(jì)還是哪兒有問(wèn)題。
手上忙,沒(méi)時(shí)間管這個(gè)。
04
幾天過(guò)后,
重新配了流動(dòng)相,
一跑,好了,如圖e。
?
雖然到底什么原因?qū)е轮胺逍蔚膯?wèn)題,
已經(jīng)無(wú)從查找
(柱子扔了,舊流動(dòng)相也沒(méi)了),
但是也給我們提供了一個(gè)解決問(wèn)題的步驟:
1
確定峰形問(wèn)題
是所有峰都有問(wèn)題,
還是就是某一個(gè)峰有問(wèn)題。
如果所有峰都有問(wèn)題,
基本都是色譜柱,
或者儀器管路連接的問(wèn)題。
如果是某一個(gè)峰有問(wèn)題,
那就要從方法上來(lái)考慮,
是否需要改變流動(dòng)相比例,
pH值,色譜柱溫度等等。
2
從jian單的做起
從不需要換什么東西的方法做起。
比如改變樣品溶劑,
反沖色譜柱等等。
3
換東西
換保護(hù)柱,換色譜柱,
換流動(dòng)相(新配),
一步一步的換,
有助于找到問(wèn)題的根本。
4
總結(jié)經(jīng)驗(yàn)
問(wèn)題解決后,
想想需不需要采取什么措施,
防止類似問(wèn)題的發(fā)生,
比如說(shuō)常換流動(dòng)相啦,
及時(shí)更換密封圈啦,
記錄進(jìn)樣次數(shù)
了解什么時(shí)候色譜柱就不行了啊之類的。
希望以上信息能夠讓各位同學(xué)
在碰到峰形不好的問(wèn)題時(shí),
有一些思路,
不至于手足無(wú)措。
也歡迎大家留言補(bǔ)充
上面沒(méi)有提到的可能影響峰形的可能。
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